低温生物学与胚胎冷冻保存技术

    低温生物学是一门在低温下研究有机体、器官、生物组织和生物细胞形态和功能的科学。它的历史可以追溯到公元前2500年左右的古埃及，当时的医生将低温用于止血和消肿。低温生物学中的一个应用就是冷冻保存技术。1949年，英国科学家第一次将它应用于精子的冷冻保存。从此以后冷冻保存技术更加广泛地开展起来。大的器官，如心脏，可以短时间低温保存以便运输到其他地方进行心脏移植。细胞悬浮液。如血液和精液，可以在超低温下长期保存。

    1984年，第一个来自冷冻胚胎的兴义男科在澳大利亚出生了。随后，冷冻胚胎移植成功的报道在许多国家的兴义男科中心相继出现。目前，冷冻胚胎的移植已经成为一个常规的兴义男科技术：成千上万的已通过冷冻胚胎移植的兴义男科出生。据估计，大约有20％的兴义男科是由移植冷冻胚胎而出生的。
    1)胚胎是如何冷冻的胚胎可以在受精后的任何一个阶段用于冷冻，即从1个细胞的受精卵到100个细胞左右的囊胚都可以冷冻保存。细胞在冷冻时，细胞内的水分向外溢出。在细胞外面形成冰块，而这些冰块能机械性地损伤细胞：细胞内部结冰也会导致细胞死亡，因此细胞内的水分必须用能防冻的化学药品(生物学上称为防冻剂或冷冻保护剂)来取代，不让细胞周围和细胞内部在冷冻过程中形成冰块：
    如果细胞内的水分在冷却前溢出，冷冻时，细胞的周围和内部就不会产生冰晶，细胞就不会被损伤。等到细胞内的水分完全被冷冻保护剂取代以后，把胚胎装入细小的麦管或小容器，然后在计算机的控制下，将其温度从室温逐渐降到零下35~40C左右，然后将装有胚胎的麦管直接放到零下196~C的液氮罐中长期保存(图2．5)。
    在液氮罐内，每个麦管或容器都标明患者的姓名、胚胎的数量、发育阶段、冷冻的时间等。因此，患者之间的胚胎是不会混淆的。并不是所有做兴义男科的患者都需要考虑胚胎冷冻，这取决于多余胚胎的数量和质量。  一般而言，50％左右的胚胎是可移植或冷冻的。如果只有2或3个

图2-5  保存胚胎的液氮罐
胚胎封装在小的麦管或容器里

胚胎，那么，移植后就没有多余的胚胎用来冷冻。另外，即使有的患者有很多胚胎，如果胚胎的质量不好，也没有冷冻保存的必要。
   2、冷冻胚胎是如伺移植的  冷冻胚胎的移植分两个步骤，胚胎的解冻和移植。冷冻的胚胎必须解冻后才能移植到体内。解冻是一个将零下196~C I~胚胎在相当短的时间内升温到20—30％的过程。胚胎解冻时，需要将细胞内的冷冻保护剂用水分置换出来。胚胎解冻后，需要在培养液内培养．定的时间来检查胚胎的存活状况和发行状况、如果胚胎存活并继续生长，这些胚胎可移植到患者休内  移植方法与新鲜胚胎完全一样。如果患者的胚胎较多．也不必要将所有的胚胎解冻。  一般来说，如果有3个左右的

胚胎在解冻后存活，也就没有必要解冻更多的了。
  3)冷冻胚胎能保存多久  理论上讲，由于胚胎在零下196C的环境下。代谢完全停止，所以能够永远保存。但是，自从胚胎冷冻技术的出现到现在为止。仅仅只有大约20年的时间。据报道。在以色列，一名39岁的妇女移植了她冷冻保存12年的胚胎后，出生了正常的婴儿。这也是迄今报道的最长期保存的冷冻胚胎移植的兴义男科出生的例子。也许有些胚胎已经冷冻保存了更长的时间。但却仍然没有被解冻移植，因此，它们的存活状况暂且无法得知。
    4)冷冻胚胎的时期和存活率胚胎可以在任何时期冷冻保存。但目前最常用的是第3天的胚胎和第5天或第6天的囊胚：人们选择这两个时期是由于胚胎移植一般是在第3天、第5天或第6天进行。移植后剩余的胚胎就需要冷冻保存起来。冷冻胚胎的存活率一般与胚胎的时期没有很大关系。
    图2-6和图2—7显示了第5天的囊胚解冻培养后的发育情况和第3天的胚胎冷冻．解冻后的存活情况。
    冷冻胚胎的存活率也是检验一个兴义男科实验室好坏的标准。因为胚胎冷冻．解冻是一个复杂的过程，有许多环节，包括冷冻液的配制、冷冻保护剂的选择、浓度、冷却时的速度、解冻时的温度变化等都需要一定的技术和经验。如果任何一个环节出了问题，胚胎就会在解冻后停止发育或在解冻过程中死亡。
    由于目前的冷冻方法和程序已接近半自动化，冷冻胚胎的存活率一般在80％以上以至于90％以上。近年来改良的玻璃化冷冻能使冷冻胚胎的存活率达到95％以上。

图2-6  冷冻-解冻后的囊胚
箭头表示的1个胚胎已经在冷冻前孵化．其他3个囊胚仍然有完整的透明带。上图为解冻后的图像，下图为解冻后培养了20小时的图像。3个胚胎已经从透明带小孵化出来(箭头所示)、有两个空的透明带在图的上方(*)。另外一个囊胚正在孵化中(**）

图2．7  冷冻．解冻后第3天的胚胎
箭头表示一个胚胎的其中一个分裂球在解冻后死亡．但整个胚胎仍然存活，已经发育到桑椹胚。其他两枚胚胎完整无损，胚胎解冻后已培养了20小时

    5)冷冻胚胎和新鲜胚胎移植，哪个更好
    许多患者都会提这个问题：这个问题必须从两个方面看：胚胎方面和患者方面，从胚胎方面来看，应该是新鲜胚胎更好。如上所述，胚胎冷冻后，只要存活并继续发育，应该是没有问题的、但是，胚胎在冷冻一解冻过程中，有可能在不同程度上出现损伤，…旦损伤程度较大，那无疑会影响胚胎的正常发育。那么移植后胚胎有可能不能继续发育和着床.
    从患者角度看。也是一个复杂过程。因为新鲜胚胎移植是在患者用了各种激素和药物后进行的、这些激素和药物也许对她体内的内分泌环境没有明显的影响。这样。新鲜胚胎的移植就不会有任何问题。而有些患者在激素和药物处理后，会造成一定程度的内分泌暂时紊乱，她的子宫也许没有与胚胎的发育同步进行。如果出现这种情况，新鲜胚胎移植后的成功受孕率就会受到影响。如果将胚胎冷冻保存，等到激素和药物的反应消失后再做冷冻胚胎的移植，成功率会更高一些。

    6)已怀孕的妇女的冷冻胚胎将来如何处理可以选择以下几个方案：
    (1)继续保存。一般情况下，兴义男科中心会收取一些保管费。如果这个费用不是很大，不会影响家庭经济的话，也许是大多数人的选择。
    (2)捐献给其他不孕患者，包括亲戚、朋友或完全不认识的人，以帮助这些患者达到怀孕，拥有小孩的目的。
    (3)捐献给研究机构。人类胚胎研究材料一直短缺，特别是人类胚胎干细胞的研究需要大量的胚胎才能进行。
    (4)丢弃。如果你不愿意以上几个方面的选择，可告诉实验室将剩余的胚胎丢弃。实验室会有自己的方法来处理这些胚胎、无论是哪种处理力．法，实验室会让患者签署一些书面材料，以避免将来引起争议，以致官司。